プライマー設計について

LAMP法について

Q.

PCRでは、プライマー、Tm等の条件は問題なく、通常なら増幅できると思われるという条件でも、何故か増幅されないということがある(こういうのをPCRマジックと呼んでいるとか)。LAMPではそのようなことはないか?

A.

本ソフトで設計されたプライマーセットで、常に増幅を保証するものではありません。増幅されない場合で、プライマーの設計に問題があると推測される場合、条件を変更して、再設計するか、設計する領域を変更してみてください。

ターゲット配列の表示・選択について

Q.

ターゲット配列エリアが表示されません。

A.

PrimerExplorerサイト「PrimerExplorer V4 操作説明」を参照してご利用のPCの設定を行ってください。

Q.

遺伝子配列のどこを選択して良いかわかりません。

A.

特に増幅領域に指定がないのであれば、遺伝子配列を3等分し、前半、中程、後半で、それぞれ設計し、1セットずつ選択して試してみるのがいいかと思われます。

配列の制限

Q.

増幅する配列に何か制限はありますか?

A.

塩基組成に極端な片よりがある場合等、増幅が困難な場合があります。

Q.

何base位まで増やすことができますか?

A.

F2からB2までの距離として、500bp程度までは増幅可能な場合もありますが、200bp以内を推奨します。

Q.

認識部位はそれぞれ何baseぐらいを目安にデザインすれば良いですか?

A.

デフォルトの値を参考に設定してください。通常各領域とも20mer程度です。

Q.

ターゲットのGC含量が多い場合のプライマー設計上の注意点は?

A.

各領域長を短めに設定します。17~20mer程度に変更してみてください。或いは、各領域のTm値を高めに設定します。

Q.

プライマー候補が多すぎます。

A.

各領域の長さの範囲を狭くします。又は、各領域のTm値の範囲を狭くします。ある程度絞られたら、候補をソートして、上位のセット候補をお使い下さい。

Q.

プライマー候補が多いのですが、そこからどのように選んで試せばいいでしょうか?

A.

任意の条件でソートすると、上位からその条件にあったセットが表示されます。基本的にはより上位のセットを試すことをお勧めします。いくつか候補を試す場合には、できるだけ、各領域がずれた候補セットを複数選択し、試すことをお勧めします。

Q.

プライマー候補が選択されません、或いは少なすぎます。

A.

遺伝子配列のGC含量をチェックしてください。
GCrichな場合は、各領域長を短めに設定します。17~20 mer程度に変更してみてください。或いは、各領域のTm値を高めに設定します。
ATrichな場合は、各領域長を長めに設定します。20~25 mer程度に変更してみてください。或いは、各領域のTm値を低めに設定します。
それでも少ない場合は、各領域の長さの範囲を広くします。又は、各領域のTm値の範囲を広くします。
この際、Number of Primersボタンを押すことで各領域(F1c,B1c,F2,B2,F3,B3)の候補数が表示されるので、特に候補が少ない領域の設計条件を緩和すると効果的です。
それにもかかわらず少ない場合は、領域内に二次構造を作りやすいなど問題があるかもしれません。
とにかく設計したい場合はAdvanced Settingのところで、各条件を緩めてください。

クローニングする場合

Q.

配列既知のcDNAのクローニングする場合に使用できますか?

A.

Targeting Rangeをbetween F1c-B1cに設定し、クローニングしたい配列を指定すると、F1-B1内にその配列が入るように設計可能です。但し、増幅長に制限がありますのでご注意下さい。

Q.

クローニングの際に制限酵素部位を挿入したい。

A.

クローニングの際に制限酵素部位を挿入したい場合は、プライマー設計後、F1cとF2の間、及びB1c-B2の間に制限酵素配列を挿入します。制限酵素配列挿入により、増幅効率が変化する場合があります。

プリント時

Q.

ループプライマーは設計できますか?

A.

ループプライマーの設計機能はバージョン2以降で対応しています。(2002年10月21日以降)

Q.

SNPs用のプライマーは設計できますか?

A.

現在のバージョンではSNPs用のプライマーの設計はサポートしていません。

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